Giriş

Osteoporoz kemik kütlesinin azalması ile karakterize bir hastalıktır. Osteoporozun tedavisinde genellikle iki yaklaşım uygulanır; ilki kemik yıkımın önleyici tedavi seçenekleri, ikincisi ise anabolizan etki gösteren ilaçların kullanılmasıdır. Bifosfonatlar iyi tolere edildikleri düşünüldüğünden yaygın olarak osteoporoz tedavisinde kullanılmaktadırlar (1). Bifosfonatların çoğu, kırıkları önlemek amaçlı oral olarak uygulanan ilaçlardır. Oral uygulama zorluğu bulunan hastalarda intravenöz uygulama avantajlı bir seçenektir (2). Bifosfonatlar kemik yıkımını osteoklast hücrelerini inhibe ederek önlerler ve kemik yapısını korurlar. Bifosfonatlar kalsiyum hidroksifosfat çözünmesini inhibe eder ve osteolizisi engellerler. Bifosfonatlar vücutta uzun yarı ömüre sahiptirler. Bifosfonatların genel gözlenen yan etkileri ateş, bulantı, kusma, kalsiyum magnezyum gibi elektrolit dengesizlikleri, göz semptomları, böbrek yetmezliği ve çene kemik nekrozudur (1-4).

Zoledronik asit (ZA), alendronat ve rizedronat ile birlikte üçüncü nesil bifosfonatlardandır. Bu ilaçlar kemik yıkımını azaltmak için kemik döngüsünü yavaşlatırlar (3). ZA, primer, sekonder ve hafif osteoporoz durumlarında kullanılmaktadır. Uzun yarı ömre sahip olduğu için yılda bir kez kullanım imkanı bulunmaktadır. ZA tedavisi ile kemik kırılmaları, özellikle de omurga kemiklerinde kırılmaların dramatik şekilde azaldığı bildirilmiştir (5). ZA, tersiyer nitrojen içeren bifosfonattır ve postmenopozal osteoporoza yönelik kullanılmaktadır. Ayrıca ZA malign ilişkili hiperkalsemi ve multipl myeloma gibi metastatik kemik hastalıklarının tedavisinde de kullanılmaktadır. ZA, postmenopozal osteoporoz için önerilen yılda bir kez 5 mg dozuna kıyasla, onkolojiyle ilişkili osteoporoz için daha yüksek dozlarda kullanımı önerilmektedir (2,6).

ZA, intravenöz uygulamadan sonra mineralize kemiklere yüksek afinite gösterir, hızlıca kemikte yüksek döngünün bulunduğu alanlarda birikir. Kemik hücrelerine endositoz ile alındığı düşünülmektedir. Kemik rezopsiyonunu farnesil pirofosfat sentazı inhibe ederek ve protein prenilasyonunu önleyerek inhibe etmektedir. ZA, hidroksiapatitlere diğer bifosfonat grubu ilaçlardan daha yüksek bir afinite ile bağlanmaktadır. Yapılan çalışmalarda ZA’nın farmakokinetik özellikleri detaylandırılmıştır. İntravenöz uygulamadan sonra hızlıca kandan kemiklere geçişi olur ve plazma miktarı hızlıca azalır. ZA, sitokrom P450 enzimleri ile metabolize olmaz ve doğrudan idrar ile atılır. ZA’nın çalışmalarda genellikle iyi tolere edildiği bildirilmiştir. İnfüzyon sonrası en yaygın gözlenen advers etkiler ateş yükselmesi (preksi), miyalji, influenza benzeri semptomlar ve artralji olarak bildirilmiştir. Daha az sıklıkta da göz enflamasyonu, bulantı, kusma gibi gastraintestinal sistem semptomları ve baş ağrısı bildirilmiş. Renal yetmezlik ve serumda kreatinin artışı diğer advers etkileri arasındadır. Ayrıca çene kemiğinde nekroza da neden olduğu bildirilmiştir (5,7).

Literatürde ZA’nın sinir sistemi veya sinir hücreleri üzerine etkisini bildiren çalışmalar kısıtlıdır (8-10). ZA kullanımında retrobulbar optik nöropati gelişimine yönelik vaka raporu literatürde yer almaktadır (11). Ancak yeni tedavi yaklaşımlarında bifosfonatların çeşitli nörolojik hastalıkların tedavisinde de kullanılabileceği gündeme gelmektedir. Yapılan preklinik çalışmalarda nitrojen içeren bifosfonatların, beyinde kalsifikasyon ile ilişkili olan Alzheimer, Huntington gibi hastalıklarda mevalonat yolağını hedefleyerek tedavi seçeneği olabileceği bildirilmiştir. Bu ilaçlar izoprenoid sentezinin inhibisyonunda rol alabilmekle birlikte bunların, çeşitli nörolojik bozuklukların ayırt edici özelliği olan bilişsel işlevlerin bozulması için kritik faktörler olarak kabul edilen beyindeki asetil kolinesteraz enzimini ve kolesterol sentezini inhibe ettiği gösterilmiştir. Bifosfonatların merkezi sinir sistemi üzerine ve görev alan moleküler yolaklar üzerine etkilerine yönelik bilgiler kısıtlıdır (12).

Bu çalışmada amaç, osteoporoz tedavisinde kullanılan ZA’nın sinir hücrelerinde sitotoksisitesinin ve oksidatif strese yönelik etkisinin total oksidan statü (TOS) ve total antioksidan statü (TAS) analizleri ile belirlenmesidir.

Gereç ve Yöntem

Kimyasallar

ZA, (toz şeklinde) Centurion Pharma (İstanbul, Türkiye) firması tarafından hediye edildi. Total Oksidan Statüs Kit ve Total Antioksidan Statüs Kitleri Elabscience Biotechnology Co., Ltd (Houston, Texas, ABD) firmasından alındı. 3-(4,5-dimetilltiazol-2-yl)-2,5 difenil tetrazolyum bromid (MTT) ve dimetisüfoksit (DMSO) Merck (Münih, Almanya) firmasından alındı.

Hücre Kültürü Uygulamaları

SH-SY5Y (CRL2266) nöroblastoma hücreleri Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu’ndan (American Type Culture Collection) alındı. Hücrelerin kültürü bu firmanın önerdiği doğrultuda gerçekleştirildi. Hücreler 37 °C ve %5 CO₂ koşullarında kültüre edildi. Kültür medyumu %10 oranında ısı ile inaktive edilmiş fötal sığır serumu ve %1 oranında antibiyotik (100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin) içeren Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-​12 besiyeri içerisinde kültüre edildi. Hücreler ko-fluent duruma geldiklerinde 3-4 günde 1 olacak şekilde pasajlandı. Bu çalışmada tüm analizler üç tekrar ve üç ayrı gün olacak şekilde uygulandı.

Sitotoksisite Testi

Sitotoksisite değerlendirmesi için MTT testi uygulandı. ZA maruziyeti uygulanmadan önce SH-SY5Y hücreleri 96 kuyucuklu mikroplakalarda 1×104 hücre/100 µL besiyeri olacak şekilde kültüre edildi ve 24 saat hücrelerin adezyonu için inkübe edildi. Sonrasında hücreler ZA ile muamele edildi. ZA stok çözeltisi 10 mm olarak hazırlandı. MTT testi için 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800 ve 1.000 µM konsantrasyonlarında ZA hücrelere uygulandı ve 24 saat 37 °C ve %5 CO₂ koşullarında inkübe edildi. Yirmi dört saat inkübasyon sonrasında 20 µl MTT çözeltisi eklendi ve 3 saat daha inkübe edildi. Sonrasında üst sıvı atılarak DMSO eklendi ve 570 nm’de absorbanslar mikroplaka okuyucu ile (Biotek, Epoch, Vermont, ABD) ölçüldü.

Total Oksidan Statü ve Total Antioksidan Statü Analizleri

MTT testi sonucunda belirlenen yarı maksimum inhibitör konsantrasyon (IC50) değerinden daha düşük ZA konsantrasyonları (400 µM, 200 µM, 100 µM ve 50 µM) TAS ve TOS analizi için 25’lik flasklarda kültüre edilmiş hücrelere 24 saat süresince uygulandı. Maruziyet uygulanan hücreler ve kontrol grubu hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ koşullarında inkübe edildi. TAS ve TOS analizi Elabscience Biotechnology Co., Ltd (Houston, Texas, ABD) firmasından alınan ELİZA kitleri ile üretici firmanın talimatlarına göre değerlendirildi. Tripsin-EDTA uygulaması ile kaldırılan hücre süspansiyonları 1.000xg’de (2-8 °C) 20 dakika süresince santrifüj edildi. Süpernatant ile çalışmaya devam edildi. Hem TAS hem de TOS analizleri için 1, 2, 4, 8 ve 16 U/mL standart seriler kit içeriğindeki çözeltiler ile hazırlandı ve çizilen standart eğriye göre deney maruziyet konsantrasyonlarında TAS ve TOS miktarları hesaplandı. TOS seviyeleri, TOS’ye karşı biyotinlenmiş antikorlar ve TAS seviyeleri, TAS’ye karşı biyotinlenmiş antikorların spektrofotometrik olarak ölçülmesi ile belirlendi. Sonuçlar hem TAS hem de TOS analizleri için U/mL olarak ifade edildi. Daha kesin bir gösterge olarak oksidatif stres indeksi (OSI), TOS’nin TAS’ye oranı olarak hesaplandı (13,14).

İstatistiksel Analiz

Veriler tek yönlü varyans analiz ANOVA ile analiz edildi, ardından post hoc Dunnett testi ve ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi. istatistik anlamlılık seviyesi p<0,05 olarak belirlendi. Tüm analizler Windows için istatistiksel paket SPSS sürüm 20.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, ABD) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Bulgular

Uygulanan 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800 ve 1.000 µM ZA konsantrasyonlarından yapılan MTT analizi sonucuna göre, SH-SY5Y hücrelerinde ZA’nın IC50 değeri 615.996 µM ve IC30 değeri 466.275 µM olarak hesaplandı. ZA’nın MTT testine göre hücre canlılığı üzerine etkisi Şekil 1’de gösterilmiştir.

TAS ve TOS analizi için IC30 değeri olan 466.275 µM’den daha düşük konsantrasyonlar (400 µM, 200 µM, 100 µM ve 50 µM) çalışmada kullanıldı. TOS analizine göre uygulanan konsantrasyon arttıkça oksidatif stres artmış görünse de istatistiksel olarak gruplar arasında anlamlı fark gözlenmedi. TAS analizi sonuçlarına göre istatistiksel olarak gruplar arasında anlamlı fark gözlenmedi. OSI’ya göre de istatistiksel olarak gruplar arasında anlamlı fark gözlenmedi (p>0,05) (Tablo 1, Şekil 2).

Tartışma

Bifosfonatların osteoporoz endikasyonu dışında çeşitli kanserler ve merkezi sinir sistemi hastalıklarında da kullanımı gündemde yer almaktadır (12,15-17). Literatürde, bifosfonatların ve ZA’nın değişik hücre hatlarında sitotoksisite değerlendirmesine yönelik, hedeflenen hücre ve doku grubu ve tedavi stratejisini değerlendirmek amacı ile çok sayıda çalışma yer almaktadır (12,18-20).

Bu çalışmada bifosfonat grubu ilaç olan ZA’nın SH-SY5Y hücrelerindeki sitotoksisite ve oksidatif stres mekanizması üzerine etkisini değerlendirdik. Çalışmamızda MTT testine göre IC50 değeri 615.996 µM olarak hesaplandı. Ayrıca TAS, TOS ve OSI analizine göre ZA’nın SH-SY5Y hücrelerinde 24 saat maruziyeti ile oksidatfi stresi indüklemediği ve hücrelerin antioksidan kapasitesini düşürmediği gözlendi.

Wang ve ark. (21) (2014) HeLa, SiHa, and CaSki servikal kanseri hücrelerinde ZA’nın 5, 50 ve 100 uM uygulamasında her üç hücre hattında da konsantrasyona bağlı olarak hücre canlılığının azaldığını bildirmişlerdir. 100 uM konsantrasyonda ise %60’dan fazla hücre canlılık inhibisyonu her 3 hücre hattında da gözlenmiştir. Singireesu ve ark. (22), 2018 Vero ve MDCK hücrelerinde ZA’nın IC50 değerini MTT testi ile yaptıkları analizde sırası ile 7,41 ve 109.58 µM olarak bildirmişlerdir. Yapılan başka bir çalışmada insan osteosarkoma MG-63 ve U-2 OS hücrelerine 0, 25, 50,100 ve 200 µM ZA 24, 48 ve 72 saat olarak uygulanmış ve hücre canlılığının her iki hücre türünde de hem konsantrasyon hem de süre ile ilişkili olarak azaldığını göstermişlerdir (16). Lang ve ark. (23), 2016, HUVEC hücrelerinde 24 saat 0 ile 500 µM konsantrasyon aralığında ZA maruziyetinin, ZA konsantrasyonu arttıkça hücre canlılığının istatistiksel anlamlı olarak azaldığını göstermişlerdir. Yapılan başka bir çalışmada SH-SY5Y hücrelerinde ZA’nın 24 saat maruziyetinde büyüme inhibisyon 50 (GI50) değeri 34,1 µM olarak bildirilmiştir (24). Bizim çalışma sonuçlarımız ile bu çalışmalardaki IC50 değer farklılıkları çalışılan hücre tipi farklılığı, maruziyet uygulama süresi farklılığı ve deney ortamları farklılığı ile ilişkili olabilir.

ZA’nın oksidatif stres mekanizması üzerine etkisine yönelik çalışmalarda birbiri ile çelişkili sonuçlar yer almaktadır. Bazı çalışmalarda oksidatif stresi azalttığı bazı çalışmalarda ise artırdığına yönelik veriler yer almaktadır. Bazı çalışmalarda özellikle kemik hücrelerinde ZA uygulamasının hücresel oksidatif stresi çeşitli moleküler yolaklar üzerinde azalttığı gösterilmiştir. Ancak literatürdeki bazı çalışmalarda ise ZA uygulamasının oksidatif stres indüklü apoptoz ve otofajiyi uyardığı gösterilmiştir (25-28). Bu çalışmada ise SH-SY5Y hücrelerinde 24 saat ZA maruziyetinde oksidatif stres artışı veya antioksidan kapasite azalması gözlenmemiştir.

Yapılan çalışmalardaki sitotoksisite ve hücresel oksidatif stres verileri ZA’nın antikanser çalışmalarında etkin bir ilaç olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, bu çalışmadan elde edilen IC50 değerinin yüksek olması, ZA uygulamasının sinir hücrelerinde sitotoksik etkisini daha yüksek konsantrasyonlarda gösterdiğini ve nöroblastoma kanser türünde etkinliğine yönelik daha detaylı araştırmalar gereksinimi olduğunu ortaya çıkarmaktadır. Başka bir açıdan bakıldığında ZA’nın Alzheimer, Huntington gibi sinir sistemi hastalıklarında da aday tedavi yaklaşımı olarak kullanılabileceğini düşünürsek, ZA’nın sinir hücrelerine hasar vermeden ve hücrelerde hücresel stres mekanizmasını tetiklemediğinden etkin tedavi seçeneği olarak karşımıza çıktığı görülmektedir.

Sonuç

Sonuç olarak, ZA’nın sinir sistemi hastalıklarında bir tedavi seçeneği olarak etkinliği, hangi moleküler mekanizmaları etkilediği ve tedavinin sonucunun kalıcılığına yönelik daha detaylı in vitro ve in vivo model çalışmalarının yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışma literatürde SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinde ZA’nın sitotoksisite derecesini ve hücresel oksidatif stres ve antioksidan kapasite üzerindeki etkisini gösteren ilk çalışmadır.

Teşekkür: Çalışma süresince desteklerinden dolayı Prof. Dr. Gül Özhan ve Prof. Dr. Sibel Özden’e teşekkür ederim.

Etik

Etik Kurul Onayı: Çalışmamız in vitro çalışma olduğundan etik kurul onayına gerek yoktur.

Hasta Onayı: Çalışma hasta onamı gerektirmemektedir.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Finansal Destek: Yazar bu çalışma için herhangi bir finansal destek almadığını bildirmiştir.