Giriş

Romatoid artrit (RA), özellikle periferik sinovyal eklemleri tutan, sinovyal hücre proliferasyon ve inflamasyonunun eklemde destrüksiyon yapması ile karakterize, etiyolojisi bilinmeyen otoimmün bir hastalıktır (1). Doğrudan eklemlerin hastalığı olarak düşünülmesine rağmen eklem dışı çeşitli sorunlara da yol açabilmektedir. Osteoporoz RA’da sık rastlanan eklem dışı sorunlardandır. Hastalığın seyri sırasında periartiküler ya da sistemik osteoporoz görülebilmektedir (2). RA patogenezinde rol oynayan çeşitli proinflamatuvar sitokinlerin osteoblast ve osteoklastlar arasındaki dengeyi bozarak kemik kaybına yol açtığı düşünülmektedir. Steroid kullanımı ve immobilizasyon gibi faktörler de kemik kaybını artırmaktadır (1). RA’da kemik kaybına bağlı olarak kırık riskinin de arttığı gösterilmiştir. Bu durum mortalitede artışa da yol açmaktadır (3-5).

Kemik dayanıklılığını kemiğin boyutu, şekli ve içeriği belirlemektedir. Kemiğin bu özelliklerini ve bunların birbiriyle olan etkisini açıklamada kemik kalitesi terimi kullanılmaktadır. Kemik kalitesindeki klinik olarak anlamlı bir değişiklik, kemiğin biyomekanik performansını değiştirmektedir. Üç nokta bükme testi gibi kemiğe yönelik biyomekanik testler kemik kalitesinin direkt göstergesidir (6).

Freud’s complete adjuvan (FCA) artriti deneysel hayvan çalışmalarında RA modeli olarak kabul edilmektedir (7,8). FCA artritinde osteoklast aktivitesinin arttığı ve rezorbsiyon lagünlerinin oluştuğu gösterilmiştir. Bu nedenle RA’ya bağlı kırık riskini değerlendirmek için de uygun bir modeldir (9-11).

Ozon doğada bulunan 3 oksijen atomundan oluşan, renksiz ve keskin kokulu bir gazdır. Medikal ozon terapisi ise saf oksijenden jeneratör yardımı ile belirli oranlarda elde edilen ozon-oksijen karışımının (%0,05-5 O3; %95-99,95 O2) değişik yöntemlerle hastaya uygulanmasını içeren bir tedavi yöntemidir (12). Ozonun RA’daki eklem bulguları üzerine olan etkinliği çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir (13-16). RA’ya bağlı gelişen kemik kırık riskini azaltmak için bugüne kadar pek çok farmakolojik ya da kimyasal ajan incelenmiştir (17,18). Biz de çalışmamızda, RA hayvan modelinde ozonun kemik dayanıklılığı üzerine olan etkisini araştırmayı amaçladık.

Gereç ve Yöntem

Çalışmada 4-5 aylık toplam 28 adet erkek Wistar sıçan kullanıldı. Sıçanlar Adnan Menderes Üniversitesi (ADU) Deney Hayvanları Araştırma Merkezi’nden temin edildi ve tüm çalışma ADU Hayvan Etik Komitesi’nin kurallarına uygun olarak yapıldı (HADYEK; 64583101/2014/084). Sıçanlar her bir grupta 7 sıçan olacak şekilde dört gruba ayrılarak işaretlendi.

Kontrol (K) grubu: Sıçanların sol arka pençelerinin palmar yüzüne 0,1 mL serum fizyolojik enjekte edildi.

Ozon (O3) grubu: Sıçanların sol arka pençelerinin palmar yüzüne 0,1 mL serum fizyolojik enjekte edildi. Çalışmanın 2. haftasından itibaren 3 hafta boyunca haftada 2 gün 40 μg/mL ozon (Photonik, Dr. Hänsler Ozonosan, Germany) intraperitoneal (ip) olarak uygulandı.

Freud’s Complete Adjuvan Artriti (FCAA) Grubu: Sıçanların sol arka pençe palmar yüzüne 0,1 mL mineral yağ içinde ısıda öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis içeren FCA (Sigma-Aldrich Chemical Co, Interlab, İstanbul, Türkiye) enjekte edilerek artrit oluşturuldu.

Freud’s Complete Adjuvan Artriti-Ozon (FCAA-O3) Grubu: Sıçanların sol arka pençelerinin palmar yüzüne 0,1 mL FCA enjekte edildi. Sıçanlara ikinci haftadan itibaren 3 hafta boyunca haftada 2 gün 40 μg/mL O3 (ip) uygulandı.
Tüm gruplara aynı çevresel koşullar sağlandı (24 °C, 12 saat gece ve 12 saat gündüz). Haftalık olarak sıçanların ağırlık takipleri ve muayeneleri yapıldı. Çalışmanın başlangıcında, ozon uygulaması öncesi ve çalışmanın sonunda kaliper ile pençe çapı ölçümleri yapılarak, başlangıçtan itibaren çap değişim oranları hesaplandı.

Altıncı haftada ketamin (50 mg/kg) ve ksilazin (5 mg/kg) anestezisi altında sıçanlar sakrifiye edildi. Kan örnekleri alınarak 1000 xg’da 10 dakika santrifüj edildi. Hazırlanan serum örneklerinde tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α), interlökin-1 (IL-1) ve IL-6 düzeyleri enzime bağlı immünosorbent testi yöntemi ile değerlendirildi.

Sıçanların femurları periostlarına zarar verilmeden çıkarılarak serum fizyolojik ile ıslatılmış gazlı bezlere sarıldı ve -25 °C’de derin dondurucuda muhafaza edildi. Mekanik test öncesi oda sıcaklığında çözdürüldü (19,20). Üç nokta bükme testi, Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji ve Gıda Güvenliği Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde bulunan Zwick-Roell cihazı kullanılarak yapıldı (Resim 1). Üç nokta bükme testi için kemikler cihaz üzerine, her bir kemik için ayrı ayrı belirlenen mesnet aralığında ve kaudo-kraniyal yönde yük uygulanacak şekilde yerleştirildi (21). Sonrasında 2 N ön yükleme ile 2 mm/dakika hızında kemik kırılıncaya kadar yükleme yapıldı. Test öncesi kemiklerin uzunlukları ve mekanik test sonrasında kraniyo-kaudal, medio-lateral endosteal ve periosteal çap ölçümleri yapıldı. Ölçülen bu çaplar kullanılarak atalet momenti (Imax) değeri hesaplandı (20,22). Kemik kırıldıktan sonra maksimum kırılma kuvveti kuvvet-deformasyon eğrisinden elde edildi. Bu eğri kullanılarak maksimum kuvvet (Fmax), katılık ve dayanım değerleri hesaplandı (22,23). İstatistiksel analizler SPSS 18.0 (SPSS Inc., Chica-go, IL, USA) kullanılarak student t test ve Mann-Whitney U test ile yapıldı. P değerinin 0,05’den düşük olması anlamlı olarak kabul edildi.

Bulgular

Sıçanların haftalık ağırlık takiplerinde gruplar arasında istatistiksel farklılık saptanmadı (p<0,05) (Şekil 1). Sıçanların başlangıçtan ozon uygulaması öncesi 2. haftaya kadar olan pençe çapı değişiklikleri incelendiğinde; FCAA ve FCAA-O3 gruplarında kontrol grubuna göre belirgin artış saptandı (p<0,001). Ozon uygulanan ve uygulanmayan FCAA’lı sıçanlar arasında istatistiksel anlamlı farklılık görülmedi (p>0,05). Tedavi sonrasında ise FCAA-O3 grubunda çalışma başlangıcına göre sadece %9,6’lık çap farkı saptanırken, bu oran FCAA grubuna göre (%35,2) belirgin şekilde düşüktü (p<0,001) (Tablo 1).

FCAA grubunda serum TNF-α düzeyi kontrol grubuna göre istatistiksel olarak yüksek bulunmasına karşılık (p<0,05), FCAA-O3 grubundaki düzeyler kontrol grubuna benzer bulundu (p>0,05). O3 grubunda da serum TNF-α düzeyleri kontrol grubuna benzerdi (p>0,05). Serum IL-1 ve IL-6 düzeylerinde ise gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05) (Şekil 2).

FCAA grubunda kemik dayanıklılığı paramatrelerinden Fmax’in kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı düşük olduğu (p<0,05), Imax’te düşme eğilimi olduğu ancak bunun istatistiksel anlamlı olmadığı görüldü (p>0,05). FCAA-O3 grubunda ise gerek Fmax, gerekse Imax’te FCAA grubuna göre yükselme eğilimi görülmesine rağmen, bu değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0,05). Dayanım ve katılık değerlerinde gruplar arasında anlamlı farklılık saptanmadı (p>0,05) (Tablo 2).

Tartışma

Ozon tedavisi ilk kez 1974’de Wolf (24) tarafından rapor edilmiştir ve son 40 yıldır Avrupa’da pek çok hastalığın tedavisinde destekleyici tedavi yöntemi olarak kullanılmaktadır (25). Antimikrobiyal, antihipoksik, immünmodülatör, antiinflamatuvar ve yara iyileştirici etkilerinin olduğu düşünülmektedir (12). Ozonun hem hücresel, hem humoral immün sistemi etkilediği, immünkompetan hücrelerin proliferasyonunu ve immünglobulinlerin sentezini stimüle ettiği saptanmıştır (26). Enfeksiyon varlığında ozon uygulaması sonrasında sitokinlerde artış olduğu bildirilmiştir (27). Ozon uygulamasından 8-9 saat sonra kanda sitokin seviyelerinde minimal artışlar saptanmıştır (28). Her uygulama sonrası ozona maruz kalan kandaki monosit ve lenfositlerin yaklaşık %4’ünde immünmodülasyon görülür (29). Bu nedenle tekrarlayan tedaviler immünmodülasyonu sağlar (28). Bizim çalışmamızda ozon uygulanan sağlıklı sıçanlarda serum TNF-α, IL-1 ve IL-6 düzeylerinde kontrol grubundan farklı olmayan minimal yükselme saptanmıştır. Bu sonuç ozonun organizma için sitokinler üzerinden zararlı bir etki oluşturmadığını da göstermektedir.

RA sinovyal inflamasyonla karakterize, kemik ve kıkırdakta destrüksiyona yol açan otoimmün bir hastalıktır (30). Hastalığın etiyolojisi kesin olarak bilinmemekle birlikte hücresel ve humoral immünitedeki birtakım bozukluklara bağlı olarak ortaya çıktığı düşünülmektedir. Özellikle T lenfositler, makrofajlar ve proliferatif sinovyal hücrelerden üretilen IL-1, IL-6 ve TNF-α gibi proinflamatuvar sitokinlerin hastalığın başlaması ve ilerlemesinden sorumlu olduğu gösterilmiştir (1,31,32). Bunlar arasında TNF-α’nın etkisinin diğer sitokinlerden 2-7 kat daha fazla olduğu ve RA’lı hastaların %50’sinin sinovyal doku ve serumunda TNF-α artışı olduğu gösterilmiştir (14,33). RA hayvan modeli olarak kabul edilen FCAA’da inflamasyonun ortaya çıkmasında sitokinlerin rol oynadığı pek çok çalışma ile gösterilmiştir (34-36). Chen ve ark. (14) bu modelin ortaya çıkmasında özellikle TNF-α’nın önemli olduğunu belirtmişlerdir. TNF-α, siklooksijenaz ve eikonozoidlerin ana üreticisi olarak gösterilmiştir ve bu, inflamasyonda önemli rol oynayan prostaglandin E’lerde artışa yol açar (37). Bu çalışmada da FCA artritli grupta serum TNF-α düzeylerinde belirgin yükseklik saptandı. Bu sonuç FCAA’nın oluşmasından sorumlu temel sitokinin TNF-α olduğunu desteklemektedir.

RA’da ozonun etkinlik ve güvenilirliği çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir (13-16). Akut artrit tedavisinde en etkin ve güvenilir doz 40 μg/mL olarak belirlenmiştir (23). Bu çalışmada da 40 μg/mL ozonun artrit semptomlarını iyileştirdiği ve herhangi bir advers etkiye yol açmadığı görülmüştür. Çalışmamızda aynı zamanda FCAA’lı sıçanlarda serum TNF-α düzeyinin yükseldiği ve ozon uygulaması (40 μg/ml) sonrasında TNF-α seviyelerinin kontrol grubundaki düzeylere düştüğü gösterilmiştir. Vaillant ve ark. (13) adjuvan uygulamasından itibaren 10 gün boyunca uygulanan 20 μg/mL ozon ile serum TNF-α düzeylerinin bizim çalışmamızda olduğu gibi, kontrol grubuna benzer seviyelerine indiğini gözlemişlerdir. Chen ve ark. (14) ise ozon tedavisi sonrasında serum TNF-α düzeylerinde değişiklik olmadığını, ancak intraartiküler TNF-α düzeylerinin azaldığını saptamışlar. Sonucun bizim çalışmadan farklı olması bu çalışmada ozonun intraartiküler olarak uygulanmasından kaynaklanıyor olabilir. Patogenezinde sitokinlerin rol oynadığı bilinen, RA dışındaki bazı hastalıklarda da sistemik yolla uygulanan ozonun serum TNF-α düzeylerini düşürdüğü gösterilmiştir (38,39). Ozonun artritteki etkisini sadece sitokinler üzerinden göstermediği, aynı zamanda antioksidanların, çeşitli büyüme faktörlerinin (trombosit türevli büyüme faktörü-α, transforme edici büyüme faktörü-β gibi) ve otokoidlerin salınımını artırdığı, dokuların dolaşımını ve oksijen kullanımını düzenlediği ve trofik süreci iyileştirdiği de düşünülmektedir (12,40). Bunun yanı sıra ozonun nöro-endokrin aksı stimüle ederek tedavi süresince hastanın kendisini daha iyi hissetmesini sağladığı da gösterilmiştir (40).

RA’da periartiküler ve sistemik osteoporoz normal popülasyondan daha fazladır (30). FCAA’nın RA’ya bağlı osteoporozu belirlemede uygun bir model olduğu önceki çalışmalarla gösterilmiştir (30,40-42). Bu çalışmada FCAA grubunun Fmax değerlerinin kontrol grubuna göre belirgin düşük olduğu, Imax değerlerinde ise düşme eğilimi olduğu gözlenmiştir. Bu sonuçlar RA hayvan modelimizde kemik dayanıklılığının azalmaya başladığının bir göstergesidir. FCA uygulaması sonrasında kemik kaybının ne kadar sürede başlayacağına dair farklı görüşler vardır. Hanyu ve ark. (43) 14. günden itibaren kemik kaybının başladığını belirtirken, Wu ve ark. (30) ise adjuvan uygulaması sonrasında en az 28 gün geçmesi gerektiğini belirtmiş ve bu nedenle incelemelerin 30. günden sonra yapılmasını önermişlerdir. Bu verilere dayanarak çalışmamızda kemik dayanıklılığı FCA uygulamasından sonraki 6. haftada değerlendirilmiştir. Ancak Enokida ve ark. (44) adjuvana bağlı artritte ilk 8 haftada sadece periartiküler kemik kaybının oluştuğunu, sistemik kaybın ise hastalığın ileri evrelerinde ortaya çıktığını saptamışlar. Hastalık ilerledikçe kaybın da giderek arttığı belirtilmiştir (30). Çalışmamızda Fmax değerlerinin belirgin etkilenmesi kemik kaybının başladığının bir göstergesidir ancak diğer parametrelerde anlamlı değişikliklerin oluşmaması modelin tam yerleşmemesinden kaynaklanmış olabilir. Ancak bu çalışma ile ozonun kemik dayanıklılığını olumsuz etkilemediği de görülmüştür.

Bu çalışmada FCAA’lı sıçanların kemik dayanıklılık parametrelerinde ozon tedavisi sonrasında anlamlı bir iyileşme saptanmamıştır. RA’ya bağlı kemik kaybında makrofajlardan üretilen sitokinler olan TNF-α, IL-6 ve IL-1 önemli rol oynamaktadır (45,46). Polzer ve ark.’na (47) göre ise primer sorumlu sitokin TNF-α’dır. Bu proinflamatuvar sitokinlerin osteoblast matürasyonunu inhibe ettiği, osteoklast farklılaşmasını ve aktivitesini artırdığı gösterilmiştir. Böylelikle osteoblast ve osteoklastlar arasındaki denge bozularak kemik kalitesinde bozulmaya yol açmaktadır (30,46). Gerek bu, gerekse önceki çalışmalarda ozon uygulamasının özellikle serum TNF-α düzeylerini olumlu etkilediği gösterilmiştir (13,14,38,39). TNF-α kemik kaybında önemli rol oynadığı için ozonun kemik dayanıklılığı üzerine etkili olması beklenmektedir. Bu çalışma ozonun kemik dayanıklılığı üzerine etkinliğinin değerlendirildiği ilk çalışmadır. Mevcut kırıklara ya da kemik gretlerine ozonun uygulandığı önceki çalışmalarda bu bölgelerde yeni kemik oluşumunu arttırdığı gösterilmiştir (26,48,49). Agrillo ve ark. (50) bifosfonata bağlı osteonekrozda ozonun etkinliğini göstermiştir. Çalışmamızda ozonun kemik dayanıklılığına etkisiz bulunması osteoporoz modelimizin tam yerleşmemesinden kaynaklanabileceği gibi, ozonun bu uygulama doz ve süresinin yeterli olmamasından da kaynaklanabilir. Bu nedenle daha uzun süreli ve farklı ozon dozlarının da değerlendirildiği yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.

Sonuç

Bu çalışmada RA hayvan modelinde kemik dayanıklılığı üzerine ozonun etkinliği gösterilememiş olmasına rağmen, TNF-α düzeylerini azalttığı ve semptomlarda düzelme sağladığı görülmüştür. Günümüzde TNF-α inhibitörlerinin de içinde bulunduğu biyolojik ajanlarla tedavide hastalığın iyileştiği ve erozyonların önlendiği gösterilmiştir (51). Bu nedenle ozon TNF-α düzeylerini düşürerek medikal tedavilere destek sağlayabilir.

Teşekkür

Bu çalışmaya verdikleri desteklerden dolayı Prof. Dr. Erkut Kara, Prof. Dr. Hüseyin Nazlıkul ve Dr. Rasime İvgin’e teşekkür ederiz.

Etik

Etik Kurul Onayı: Adnan Menderes Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi’nden onay alındı (HADYEK; 64583101/2014/084).

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Cerrahi ve Medikal Uygulama: Gülnur Taşçı Bozbaş, Buket Demirci, Konsept: Gülnur Taşçı Bozbaş, Gülcan Gürer, Dizayn: Gülnur Taşçı Bozbaş, Buket Demirci, Veri Toplama veya İşleme: Gülnur Taşçı Bozbaş, Figen Sevil Kilimci, Mustafa Yılmaz, Analiz veya Yorumlama: Gülnur Taşçı Bozbaş, Gülcan Gürer, Literatür Arama: Gülnur Taşçı Bozbaş, Yazan: Gülnur Taşçı Bozbaş.

Çıkar Çatışması: Yazarlar tarafından çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Finansal Destek: Çalışma Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri tarafından desteklenmiştir [ADU Research Funding (TPF-15047)].